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CRISPR-Cas9 protein purification

E. coli culture for Cas9 overexpression

1. His-tagged Cas9을 encoding하는 pET28-Cas9 plasmid를 BL21(DE3)에 transformation한다.
2. 50ug/mL kanamycin이 포함된 LB 40mL에 fresh colony를 접종한다.
3. 37°C, 200rpm에서 overnight pre-culture한다.
4. Overnight culture 8mL를 50ug/mL kanamycin이 포함된 fresh LB 400mL로 옮긴다.
5. 28°C, 200rpm에서 2hr incubation한다.
6. OD550을 측정하고 mid-log phase(A550=0.6)에 도달했는지 확인한다.
7. IPTG를 final 0.5mM로 처리해 Cas9 expression을 induction한다.
8. 18°C에서 overnight incubation한다.

Purification of target protein

1. 4°C에서 4000rpm, 10min centrifuge하여 cell을 harvest한다.
2. 400mL culture당 lysis buffer 5mL로 pellet을 resuspend한다.
3. Lysis buffer는 20mM Tris-HCl pH 8.0, 300mM NaCl, 10mM beta-mercaptoethanol, 1% Triton X-100, 1mM PMSF 조성으로 준비한다.
4. Ice 위에서 sonication한다.
5. Sonication은 200-300W에서 10sec pulse on, 10sec cooling 조건으로 총 3min 수행한다.
6. 4°C에서 4000rpm, 30min centrifuge한다.
7. Supernatant를 회수한다.
8. Amicon Ultra 50K를 이용해 buffer exchange를 수행한다.