Source file: (Bacteria) Cas9 Protocol.docx

Cas9 Protocol

Cas9 induction & purification

  1. Cas9 expression construct를 E. coli에 도입한다.
  2. Cas9 induction 조건에 맞추어 culture와 induction을 진행한다.
  3. Cell harvest 후 lysis와 Ni-NTA purification을 수행한다.
  4. 필요한 경우 buffer exchange와 concentration을 진행한다.

Cas9 gRNA design

  1. sgRNA target spacer 20bp를 선정한다.
  2. sgDNA oligo는 T7 promoter, TATA box, G, spacer, scaffold homologous part 순서로 구성한다.
  3. PcURA3 example target은 아래 서열을 사용할 수 있다.
Name Sequence
PcURA3 T1 GCACATAATATAATTCAAAA
PcURA3 T2 TCTTTGAGAATAAGATAATG
PcURA3 T3 AGAAGCTCACCCTTCTCCAT

gRNA Extension PCR mixture

Reagent Volume Unit
Primer F (100pmol) 2 uL
Primer R (100pmol) 2 uL
Phusion E 0.5 uL
5X buffer 10 uL
dNTP 10 uL
dH2O 26 uL
Total 50 uL

Extension PCR condition

Step Temperature Time Cycle
Initial denaturation 98°C 2:00 1
Denaturation 98°C 0:10 35
Annealing 58°C 0:10 35
Extension 72°C 0:20 35
Final extension 72°C 5:00 1
Hold 4-20°C Hold -

In vitro transcription mixture

Reagent Volume Unit
Template 10 uL
rNTP 16 uL
MgCl2 28 uL
10X buffer 10 uL
T7 RNA Pol 5 uL
Inhibitor 1 uL
DEPC dH2O 29 uL
DTT (100mM) 1 uL
Total 100 uL

Guide RNA in vitro transcription procedure

  1. Primer F는 sgRNA, primer R은 Universal primer를 사용해 extension PCR을 수행한다.