Yeast chromosomal DNA isolation

  1. 14mL round-bottom tube에 YPD media를 3mL 넣고 single colony를 overnight culture한다.
  2. EP tube에 culture 1.5mL를 옮기고 13,000rpm 10min centrifuge 후 supernatant를 제거한다.
  3. Add 50uL STES buffer and 50uL acid washed 0.4mm glass beads.
  4. Tip을 이용해서 glass beads가 cell pellet보다 아래로 내려갈 수 있도록 섞어준다.
  5. STES buffer는 0.5M NaCl, 0.2M Tris-HCl pH 7.5, 0.01M EDTA, 1% SDS이다.
  6. Vortex 3min with multiple microtube mixer (TOMY).
  7. Add 200uL TE, pH 8.0.
  8. Add 200uL phenol/chloroform/isoamyl alcohol, pH 8.0.
  9. Vortex 3min with TOMY.
  10. Centrifuge 13,000rpm 10min 후 supernatant, TE층 170-180uL를 새 EP tube로 옮긴다.
  11. 하층액이나 흰색 막이 섞여 들어가지 않도록 주의한다. 섞이면 PCR 효율을 저해할 수 있다.
  12. Add 17-18uL, 0.1X volume, of 3M Sodium Acetate.
  13. Add 500uL 100% EtOH, 2-3X volume, and incubate at -20C for 30min.
  14. Centrifuge 13,000rpm 10min and discard the supernatant.
  15. Add 1mL 70% EtOH.
  16. Vortex at RT for 10min.
  17. Centrifuge 13,000rpm 10min and discard the supernatant.
  18. Dry in an oven for 20min or at RT for 1hr 30min.
  19. Dissolve into 50-200uL 1X RW, restriction buffer containing 20ug/mL RNaseA.