Cloning

1. Vector를 restriction enzyme으로 cutting 한다. Calculator를 참조한다.
2. Electrophoresis를 1% agarose gel, 1X TAE, 100V, 35min 조건으로 진행한다.
3. UV lamp 위에서 깨끗하고 날카로운 면도날로 agarose gel에서 DNA 밴드를 잘라낸다. UV는 최소로 켜두어 DNA degradation을 방지한다.
4. EP tube에 gel 조각의 무게를 측정한다.
5. DNA 조각 무게에 따라 Power Gel Extraction buffer를 추가한다. mg x 3uL 기준으로 넣는다.
6. Gel extraction kit는 Dyne Cat. No. A550 kit를 사용한다.
7. Dry oven에서 20min 동안 agarose gel을 녹인다.
8. Collection column에서 13,000rpm, 1min, 4C로 centrifuge한 뒤 supernatant를 제거한다.
9. Wash buffer 750uL을 넣고 13,000rpm, 1min, 4C로 centrifuge한 뒤 supernatant를 제거한다.
10. 13,000rpm, 1min, 4C로 다시 centrifuge한 뒤 남은 supernatant를 제거한다.
11. TE buffer 20uL을 추가한다.
12. TE buffer는 10mM Tris-Cl, 1mM EDTA, pH 8.0이다.
13. 13,000rpm, 1min, 4C로 centrifuge한다.

Gibson assembly

1. Gibson master mixture, backbone, insert를 PCR tube에 농도에 맞게 섞는다.
2. PCR machine에서 50C 1hr, 4C infinity로 incubation한다.
3. Vector DNA는 100ng를 사용한다.
4. Insert DNA는 vector의 molar ratio x 3으로 사용한다.
5. H2O를 넣어 total 10uL로 맞춘다.