목적

Restriction enzyme으로 절단한 vector backbone에 insert를 조립하고, DH5α transformation과 miniprep을 거쳐 sequencing 가능한 plasmid를 확보한다.

적용 범위

• LentiCRISPR KO vector cloning
• Gibson assembly, In-Fusion cloning 또는 T4 ligation
• 원본 파일: Protocol/(Bacteria) Cloning.docx

준비 및 확인

• Vector, insert, 적절한 restriction enzyme
• 1% agarose gel, 1X TAE
• Gel extraction kit: Dyne Power Gel Extraction, Cat. No. A550
• DH5α competent cell
• LB media, LB-Ampicillin plate
• Miniprep kit, sequencing primer

Vector 절단 및 Gel Extraction

1. Calculator를 이용해 vector와 restriction enzyme 반응량을 계산한다.
2. 1% agarose gel, 1X TAE, 100 V, 35 min 조건으로 전기영동한다.
3. UV 노출을 최소화하며 깨끗한 면도날로 목표 DNA band를 절취한다.
4. Gel 조각 무게를 측정하고 무게 1 mg당 Power Gel Extraction buffer 3 µL를 넣는다.
5. Dry oven에서 20 min 동안 agarose gel을 녹인다.
6. Collection column에서 13,000 rpm, 1 min, 4°C 원심분리 후 여액을 제거한다.