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Sample Prep, SDS gel, Western Blot SOP

Reagents

Reagents
Lysis Buffer 10X
Protease inhibitor 1
Protease inhibitor 2
Protease inhibitor 3
PMSF 100mM
BSA 1 mg/mL
5X Sample loading buffer (SB)
5X Bradford

1. Cell lysis for protein extraction

  1. Cell 동결 후 lysis buffer를 이용해 protein을 추출한다.
  2. Ice 안에서 진행하고, centrifuge는 미리 4°C로 설정한다.
  3. 10X lysis buffer를 1X로 희석하여 사용한다.
  4. Protein inhibitor 1, 2, 3과 PMSF를 포함해 총 1mL lysis buffer를 만든다.
Lysis Buffer 10X Protease inhibitor 1 Protease inhibitor 2 Protease inhibitor 3 PMSF 100mM DW
100 uL 10 uL 10 uL 10 uL 10 uL 860 uL
  1. 동결된 sample이 녹은 뒤 1X lysis buffer 50-60uL를 처리한다.
  2. Scraper로 긁어내며, scraper는 사용할 때마다 DW로 헹군다.
  3. Ice에서 약 1hr 보관하며 10min마다 vortexing한다.
  4. 13,000rpm, 20min 원심분리한다.
  5. 밑의 membrane 성분을 피하고 상층액만 새 tube에 보관한다.

2. Bradford assay

  1. 96-well plate를 준비한다.
  2. BSA standard와 sample의 흡광도 차이를 이용해 단백질을 정량한다.
  3. BSA standard는 0-6uL를 triplicate로 넣는다.
  4. Sample은 1uL씩 duplicate 또는 triplicate로 넣는다.