Source file: (Bacteria) sgRNA in vitro transcription.docx

sgRNA in vitro transcription

Oligo design

  1. Oligo 주문을 통해 Universal scaffold와 sgRNA IVT를 주문한다.

  2. Universal scaffold sequence는 다음을 사용한다.

    5'-AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3'

  3. sgDNA는 다음 구조를 사용한다.

    5' GAAATTAATACGACTCAC / TATA / G / X20 / GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3'

  4. X20 spacer 위치에 sgDNA part 20bp를 삽입한다.

sgRNA IVT sequence structure

Part Sequence / Note
T7 promoter GAA ATT AAT ACG ACT CAC
TATA box TATA
G Transcription start G
Spacer X20
Scaffold homologous part GTTT TAG AGC TAG AAA TAG CAA G

Universal primer

Name Sequence
SpCas9_sgR_R_Universal 5' AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC 3'

Extension PCR

  1. PCR tube에 sgRNA primer와 Universal primer를 사용해 extension PCR mixture를 만든다.
  2. PCR machine을 아래 조건으로 설정한다.
Step Temperature Time Cycle
Initial denaturation 98°C 2:00 1
Denaturation 98°C 0:10 35
Annealing 58°C 0:10 35
Extension 72°C 0:20 35
Final extension 72°C 5:00 1
Hold 4-20°C Hold -

In vitro transcription mixture

Reagent Volume Unit
Template 10 uL
rNTP 16 uL
MgCl2 28 uL
10X buffer 10 uL
T7 RNA Pol 5 uL
Inhibitor 1 uL
DEPC water 29 uL
DTT (100mM) 1 uL
Total 100 uL

Procedure

  1. Extension PCR 산물을 clean up kit로 정제하고 30uL DEPC water로 elution한다.
  2. EP tube에 in vitro transcription mixture를 만든다.